Sequencing

GENOME/EXOME SEQUENCING (WGS)

Per Whole Genome (re)Sequencing (WGS) si intende il (ri)sequenziamento di un intero genoma (WGS), sia esso Virale, Batterico, Fungino, Animale o Vegetale. Fornisce la mappa più completa della composizione genetica di un organismo. Il metodo consente l'analisi di vari polimorfismi genetici (variazioni a singola base, inserzioni, delezioni, inversioni, riarrangiamenti complessi, variazione del numero di copie). A differenza del sequenziamento dell'esoma, il WGS copre tutte le coordinate dell'intero genoma di un organismo, che è probabilmente il dato molecolare più importante. Per i batteri, questo approccio è altamente efficace per lo studio della virulenza, della resistenza ai farmaci o di nuovi bersagli farmacologici. Allo stesso modo, la genomica comparativa per eucarioti mediante resequencing o assemblaggio de novo è l'approccio migliore per ottenere variazioni genomiche ad alta risoluzione.

Quando non si ha a disposizione un Riferimento, l'assemblaggio de novo consente di ottenere la sequenza dell'intero genoma. Per una corretto assemblaggio de novo dell'intero genoma, una combinazione di reads più corte e contigs più lunghe consente la caratterizzazione di qualsiasi genoma.
L'assemblaggio de novo richiede un maggior Coverage rispetto ad un assemblaggio con Riferimento (vedi sezione Bioinformatica o contattaci a Questo indirizzo email è protetto dagli spambots. È necessario abilitare JavaScript per vederlo.).

Per Whole Exome Sequencing (WES) si intende il sequenziamento selettivo della regione di codifica (Esoni), che costituisce per esempio l'1-2% del genoma umano. È un modo più economico ed efficace di sequenziamento rispetto al sequenziamento dell'intero genoma. Il sequenziamento dell'esoma può essere efficacemente utilizzato nella ricerca di malattie rare, genomica del cancro e disturbi genetici. Bio-Fab Lab usa differenti metodi di cattura degli esoni per fornire il servizio di sequenziamento degli esomi.


TRANSCRIPTOME SEQUENCING (RNA-Seq)

L'RNA-Seq (sequenziamento dell'RNA), chiamato anche Whole Transcriptome Sequencing (WTS), utilizza il sequenziamento di terza generazione per rivelare la presenza e la quantità di RNA in un campione biologico in un dato specifico momento o sotto determinate condizioni fisiologiche, patologiche o sperimentali. Nello specifico, l'RNA-Seq consente di esaminare isoforme, modificazioni post-trascrizionali, fusioni geniche, mutazioni/SNP e variazioni nell'espressione genica nel tempo o differenze nell'espressione genica in diversi gruppi o trattamenti. Oltre alle trascrizioni dell'mRNA, l'RNA-Seq può esaminare diverse popolazioni di RNA incluso l'RNA totale, piccoli RNA, come i miRNA, i tRNA e il Ribosom profiling (Ribo-seq). L'RNA-Seq può anche essere usato per determinare i confini esone/introne e verificare o modificare i limiti 5′ e 3′ di geni precedentemente annotati. Il sequenziamento dell'intero trascrittoma è un progresso importante nello studio dell'espressione genica rispetto ai tradizionali approcci basati sul microarray in quanto fornisce una visione completa di un profilo trascrizionale cellulare in un dato momento biologico consentendo un'analisi non solo qualitativa ma anche quantitativa del trascrittoma. Fornisce inoltre informazioni su diverse variazioni che si verificano a livello di RNA, di modifiche post-trascrizionali come varianti di giunzione e isoforme. Le informazioni che è possibile ottenere sono dipendenti dal Coverage (vedi sezione Bioinformatica) L'analisi del profilo di espressione, dai dati di sequenziamento di RNA-Seq, offre una visione più completa del livello di trascrizione dei singoli RNA in studio. Gli standard attuali e le linee guida per RNA-seq richiedono che la dimensione media dell'inserto della libreria è di 200 coppie di basi. Gli esperimenti dovrebbero avere due o più replicati. Ogni replicato dovrebbe avere 30 milioni di reads allineate, anche se i primi progetti miravano a 20 milioni di reads allineate.


ASSAY for TRASPOSASE-ACCESSIBLE CHROMATIN (ATAC-Seq)

L'esperimento della cromatina accessibile alla trasposasi, seguito da sequenziamento (ATAC-Seq) fornisce i profili genomici di accessibilità alla cromatina. In breve, il metodo ATAC-Seq funziona come segue: la trasposasi caricata inserisce i primer di sequenziamento in siti di cromatina aperti del genoma e le reads vengono quindi sequenziate. Le estremità delle reads indicano i siti di cromatina aperti.


SMALL RNA SEQUENCING

Il sequenziamento di piccoli RNA non codificanti (small noncoding RNA-seq) è un protocollo di RNA-Seq usato per sequenziare differenti specie di piccoli RNA come i microRNAs (miRNAs). miRNA-Seq differisce da altre forme di RNA-seq in quanto il materiale di input è spesso arricchito per piccoli RNA, da 17 a 35 nucleotidi. miRNA-Seq consente di esaminare schemi di espressione tessuto-specifici, le associazioni di malattie, le isoforme dei miRNA e di scoprire miRNA precedentemente non caratterizzati. La disregolazione dei miRNA svolge un ruolo importante in numerose malattie, ciò rende il miRNA-seq uno strumento importante per la diagnostica e la prognostica, come biomarcatori e/o predittori di malattia.


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