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sequenziamento di nuova generazione resequincing
 

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Come preparare i campioni
 

1) CAMPIONI di DNA o RNA per la preparazione delle librerie

• Protocollo Genomic DNA-seq e targeted resequencing
• Protocollo Genomic DNA Mate Pair
• Protocollo ChIP-seq
• Protocollo di RNA-seq (total RNA, mRNA)
• Protocollo di smallRNA-seq
• Protocollo 16S rRNA sequencing

2) CAMPIONI di librerie già pronte per generazione cluster e sequenziamento
3) Spedizione dei campioni

Per lo svolgimento del servizio NGS Bio-Fab sono accettati esclusivamente i seguenti campioni:

- DNA o RNA per la preparazione delle librerie, con i requisiti di qualità e quantità come indicati in questa pagina per ciascun protocollo (si consiglia di attendere sempre le indicazioni del laboratorio, perché le richieste possono variare leggermente a seconda dell’applicazione richiesta)
- Librerie già pronte per la fase di generazione ed amplificazione dei cluster, e successivo sequenziamento con piattaforma Illumina

1) CAMPIONI di DNA o RNA per la preparazione delle librerie

- Protocollo Genomic DNA-seq e targeted resequencing

• DNA a doppio filamento non degradato e non contaminato da RNA, proteine, sali ed alcoli;
• Quantitativo compreso tra 1 e 5 µg totali risospeso in dH2O (si raccomanda di inviare il quantitativo massimo) ad una concentrazione minima di 100ng/ul;
• Rapporto 260/280 pari a 1,8 e rapporto 260/230 >2.

Raccomandazioni: Per la quantificazione si sconsigliano metodi spettrofotometrici, così come il Nanodrop, che non riescono a discriminare in maniera accurata tra molecole di dsDNA, ssDNA, RNA e nucleotidi presenti nel campione. E' necessario valutare la qualità e l'integrità di un campione di DNA anche attraverso una corsa elettoforetica in gel d'agarosio ed allegare al campione inviato un'immagine della corsa sul gel.

Note: La Bio-Fab garantisce il servizio di quantificazione di DNA per questo protocollo. Per il costo del servizio consultare il LISTINO PREZZI NGS.

- Protocollo Genomic DNA Mate Pair

• DNA a doppio filamento non degradato e non contaminato da RNA, proteine, sali ed alcoli;
• Quantitativo minimo da inviare: 10 µg totali risospeso in dH2O;
• Rapporto 260/280 pari a 1,8 e rapporto 260/230 >2.

Raccomandazioni: Per la quantificazione si sconsigliano metodi spettrofotometrici, così come il Nanodrop, che non riescono a discriminare in maniera accurata tra molecole di dsDNA, ssDNA, RNA e nucleotidi presenti nel campione. E' necessario valutare la qualità e l'integrità del DNA correndo una piccola quantità di campione (200 ng) in un gel a bassa percentuale di agarosio (0,6%).

Il DNA di ottima qualità dovrebbe corrispondere ad una banda in genere maggiore di 50 kb con eventuale minima presenza di leggero smearing a basso peso molecolare. Se la maggior parte del DNA mostra una taglia inferiore ai 50 kb e lo smearing è chiaramente visibile, il DNA è da considerarsi degradato. Allegare un'immagine della corsa del gel al campione inviato.

Note: La Bio-Fab garantisce il servizio di quantificazione di DNA per questo protocollo. Per il costo del servizio consultare il LISTINO PREZZI NGS.

- Protocollo ChIP-seq

• DNA a doppio filamento immunoprecipitato, non degradato e non contaminato da RNA, proteine, sali ed alcoli;
• Quantitativo minimo da inviare: 10 ng DNA immunoprecipitato risospeso in dH2O (eluiti nel volume minore possibile).

Note: La Bio-Fab garantisce il servizio di quantificazione di DNA per questo protocollo. Per il costo del servizio consultare il LISTINO PREZZI NGS

- Protocollo di RNA-seq (total RNA, mRNA)

• RNA totale purificato non degradato e non contaminato da proteine, solventi organici e sali;
• Quantitativo compreso tra 1 e 4 µg totali risospeso in dH2O nuclease-free (si raccomanda di inviare il quantitativo massimo) ad una concentrazione minima di 100ng/ul;
• 2100 Bioanalyzer RNA Integrity Number (RIN) = 8;
• 28S rRNA : 18S rRNA = 2 : 1
• Rapporto 260/280 >1,8

Raccomandazioni: L'invio di quantità inferiori a quelle richieste può comportare una riduzione di resa nella preparazione della libreria, così come l'RNA degradato o contaminato da molecole di DNA. Quindi è estremamente importante utilizzare RNA di alta qualità come materiale di partenza. Si raccomanda di includere un passaggio in DNase durante il protocollo di isolamento dell'RNA. Contaminanti di DNA possono essere tuttavia rimossi durante la purificazione del mRNA.

E' necessario valutare l'integrità dell'RNA correndolo in un gel di agarosio con formaldeide 1% e colorando con etidio bromuro. RNA di alta qualità mostra una banda di 4,5 kb corrispondente al rRNA 28S. Questa banda dovrebbe avere un'intensità di segnale due volte maggiore di quella mostrata dalla banda del rRNA 18S di 1,9 kb. Allegare un'immagine della corsa del gel al campione inviato.
Qualora si decida di partire da mRNA piuttosto che da RNA totale, è necessario usare la frazione di mRNA purificato da 0,1 – 4 µg di RNA totale.

Note: La Bio-Fab garantisce il servizio di quantificazione di RNA per questo protocollo. Per il costo del servizio consultare il LISTINO PREZZI NGS.

- Protocollo di smallRNA-seq

• RNA totale purificato non degradato e non contaminato da proteine, solventi organici e sali;
• Quantitativo minimo da inviare: 1 µg totale risospeso in dH2O nuclease-free;
• 2100 Bioanalyzer RNA Integrity Number (RIN) = 8;
• 28S rRNA : 18S rRNA = 2 : 1
• Rapporto 260/280 >1,8

Raccomandazioni: L'invio di quantità inferiori a quelle richieste può comportare una riduzione di resa nella preparazione della libreria, così come l'RNA degradato o contaminato da molecole di DNA. Quindi è estremamente importante utilizzare RNA di alta qualità come materiale di partenza. Si raccomanda di includere un passaggio in DNase durante il protocollo di isolamento dell'RNA. Contaminanti di DNA possono essere tuttavia rimossi durante la purificazione del mRNA.

E' necessario valutare l'integrità dell'RNA correndolo in un gel di agarosio con formaldeide 1% e colorando con etidio bromuro. RNA di alta qualità mostra una banda di 4,5 kb corrispondente al rRNA 28S. Questa banda dovrebbe avere un'intensità di segnale due volte maggiore di quella mostrata dalla banda del rRNA 18S di 1,9 kb. Allegare un'immagine della corsa del gel al campione inviato.
Qualora si decida di partire da small RNA piuttosto che da RNA totale, è necessario usare la frazione di smallRNA purificato da 1 -10 µg di RNA totale.

Note: La Bio-Fab garantisce il servizio di quantificazione di RNA per questo protocollo. Per il costo del servizio consultare il LISTINO PREZZI NGS.

- Protocollo 16S rRNA sequencing

• DNA non degradato e non contaminato da RNA, proteine, sali ed alcoli;
• Quantitativo di circa 500ng totali risospesi in dH2O (si raccomanda di inviare il quantitativo massimo) ad una concentrazione minima di 50ng/ul;
• Rapporto 260/280 pari a 1,8 e rapporto 260/230 >2.

Raccomandazioni: Per la quantificazione si sconsigliano metodi spettrofotometrici, così come il Nanodrop, che non riescono a discriminare in maniera accurata tra molecole di dsDNA, ssDNA, RNA e nucleotidi presenti nel campione. E' necessario valutare la qualità e l'integrità di un campione di DNA anche attraverso una corsa elettoforetica in gel d'agarosio ed allegare al campione inviato un'immagine della corsa sul gel.

Note: La Bio-Fab garantisce il servizio di quantificazione di DNA per questo protocollo. Per il costo del servizio consultare il LISTINO PREZZI NGS.

2) Librerie già pronte per generazione cluster e sequenziamento

• Quantitativo: 10 µl di una soluzione in dH2O concentrata 10nM;
• Verifica sempre la compatibilità degli index utilizzati

Raccomandazioni: L'invio di quantità inferiori a quelle richieste può comportare una riduzione della formazione dei cluster. Quindi è estremamente importante determinare le concentrazioni dei campioni ricavabili facendo una lettura al QuBit, Bioanalyzer e qPCR (come descritto nel qPCR Quantification Protocol Guide dell'ILLUMINA).

Note: La Bio-Fab garantisce il servizio di quantificazione di DNA per questo protocollo. Per il costo del servizio consultare il LISTINO PREZZI NGS.

3) Spedizione dei campioni

I campioni vanno spediti all'interno di provette da 1,5 ml DNasi/RNasi free, sigillate, numerate in maniera progressiva e nominate singolarmente con i nomi dei campioni che contengono. Si raccomanda di spedire i campioni congelati, in ghiaccio secco, con corriere espresso, con consegna garantita entro le 24 ore.

La spedizione dei campioni o della libreria è sempre successiva all'accettazione del form di accesso al servizio da parte della Bio-Fab, e successiva all'accettazione delle condizioni di vendita da parte del cliente.

Spedire i campioni al seguente indirizzo:

Bio-Fab Research srl

Servizi di supporto alla ricerca
Dr. Fabio Riccobono
c/o Dipartimento di Clinica e Terapia Medica
Ala Scientifico-Didattica
2° piano – Edificio I^ Clinica Medica (ex Idrologia)
Policlinico Umberto I
Viale del Policlinico, 155
00161 ROMA

Per ogni ulteriore informazione inviare una e-mail all'indirizzo ricerca-sviluppo@biofabresearch.it

 
 
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