Come preparare i campioni

Quantita’ da inviare
Form
Servizio di Purificazione dei prodotti di PCR
Preparazione provette e compilazione del form
Spedizione campioni
Risultati

Per avere buone sequenze bisogna avere un buon DNA. Ecco alcuni suggerimenti per preparare i tuoi campioni da sequenziare…e non dimenticare di eluire SEMPRE in ACQUA DISTILLATA!

Preparazione del DNA plasmidico:
• Usare ceppi batterici che non ricombinano (DH5a, HB101, XL1 Blue ecc.)
• Evitare contaminazioni (Genomico, RNA, proteine, Sali ecc)
• Estrarre il DNA con i kit commerciali con tecnologia a scambio ionico o per assorbimento membrana di silice
• Eliminare contaminanti che inibiscono la polimerasi (EDTA, Etanolo ecc)
• Eluire in acqua distillata
• Quantificare il DNA allo spettrofotometro (260/280 maggiore o uguale a 1.8)

Preparazione dei campioni da PCR:
• Amplificare nel modo più specifico possibile cercando di consumare tutti gli oligo durante la reazione e controllare il prodotto ottenuto su gel di agorosio
• Evitare contaminazioni (Genomico, RNA, proteine, Sali ecc)
• Estrarre il DNA con i kit commerciali con tecnologia ad assorbimento su membrana di silice o eventualmente fare una gel filtrazione (G50 sephadex)
• Evitare se possibile di estrarre il DNA dal gel di agarosio
• Eliminare contaminanti che inibiscono la polimerasi (EDTA, Etanolo, ecc)
• Eluire in acqua distillata
• Quantificare il DNA allo spettrofotometro (260/280 maggiore o uguale a 1.8)

Preparazione dei campioni per la sola elettroforesi:

Se volete fare da soli la reazione di sequenza dovete:
• Utilizzare il kit Big Dye Terminator V1.1 dell'AppliedBiosystems (P/N 4337450) o V3.1 (P/N 4337455)
• Purificare i campioni dal non incorporato (noi consigliamo la gel filtrazione con G50 sephadex)
• Utilizzare provette da 0,2 ml o micropiastre a 96 pozzetti per la spedizione dei campioni LIOFILIZZATI

Quantita’ da inviare

PLASMIDICO PLASMIDICO CON RICHIESTA NOSTRI OLIGO
Dna 800ng + Oligo 10pmoli = 20 µl Volume finale.
Fino a 5Kb vettore +inserto (aggiungere altri 100ng ogni 5Kb). 
Dna 800ng SENZA OLIGO = 15µl Volume finale.
Fino a 5Kb vettore +inserto (aggiungere altri 100ng ogni 5Kb).
PCR PCR CON RICHIESTA NOSTRI OLIGO
DNA10 ng ogni 100bp di amplificato +
Oligo 10pmoli=20µl Volume finale.
DNA 10ng ogni 100bp di amplificato
SENZA OLIGO = 15µl Volume finale.
Fino a 2000bp, contattare il lab per frammenti >2000bp Fino a 2000bp, contattare il lab per frammenti >2000bp

Nel caso in cui non avete disponibile la quantità richiesta potete comunque inviare la quantità minima (ricordatevi di barrare la casella quantità minima nel form) quindi:

PLASMIDICO PLASMIDICO CON RICHIESTA NOSTRI OLIGO
Dna 400ng + Oligo 5pmoli = 10 µl Volume finale.
Fino a 5Kb vettore +inserto (aggiungere altri 100ng ogni 5Kb). 
Dna 400ng SENZA OLIGO = 7.5 µl Volume finale.
Fino a 5Kb vettore +inserto (aggiungere altri 100ng ogni 5Kb).
PCR PCR CON RICHIESTA NOSTRI OLIGO
DNA 6.5 ng ogni 100bp di amplificato + Oligo
5pmoli=10µl Volume finale.
DNA 6.5 ng ogni 100bp di amplificato SENZA OLIGO =
7.5µl Volume finale.
Fino a 2000bp, contattare il lab per frammenti >2000bp Fino a 2000bp, contattare il lab per frammenti >2000bp

Form
Per prenotare la corsa e per facilitare il nostro lavoro dovresti riempire il form in formato .xls con il PC ed inviarlo via e-mail all'indirizzo: Questo indirizzo email è protetto dagli spambots. È necessario abilitare JavaScript per vederlo.
Lo stesso form va stampato riducendo il set up fino al riempimento di un solo foglio ed inviato insieme ai campioni.

Excel
DOWNLOAD FORM CAMPIONI SINGOLI

Excel
DOWNLOAD FORM PER LE PIASTRE

Servizio di Purificazione dei prodotti di PCR
La purificazione dei prodotti di PCR viene effettuata in high throughput utilizzando kit commerciali a membrana di silice.È importante che il prodotto di PCR abbia una banda sola.
Materiale da inviare:
1) 50 ul della reazione di PCR in provette da 0,2 ml

2) Oligo concentrati 2 pmoli/µl (2 µM). Il volume di oligo deve essere proporzionale alla quantità di reazioni (volume= 6µl X n.campioni da sequenziare)e deve essere consegnato in provette da 0,2 ml

3) Form compilato come da indicazioni Bio-Fab:
- nominare i campioni con cognome e numero progressivo (a partire da 01) e poi aggiungere altre informazioni come nome del templato e dell’oligo.
- Elencare prima tutti i campioni da purificare e poi in coda quelli eventualmente da sequenziare con altri oligo.
- Nel caso in cui si debba sequenziare un campione con più oligo si deve compilare il form mettendo prima tutti i campioni da sequenziare con il “primo oligo” e, proseguendo la numerazione progressiva, aggiungere i nomi dei campioni da sequenziare anche con altri oligo riportando tra parentesi il riferimento al campione originario, e quindi al numero della provetta.

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- Indicare sempre la lunghezza degli amplificati.

4) La foto degli amplificati, 5 ul delle PCR, corsi su gel d’agarosio è fortemente consigliata. Devono essere indicate le dimensioni della banda e quella del marker di riferimento.

Preparazione provette e compilazione del form
Ricordati di seguire sempre queste indicazioni:
- Inviare i campioni in provette da pcr da 0,2 ml;
- numerare le provette sul tappo e sempre in ordine progressivo a partire da 01, senza ripetizioni e senza saltare numeri. La numerazione delle provette deve corrispondere alla numerazione riportata sul form;
- nel caso in cui utilizziate le piastre vanno orientate come in figura, quindi il campione n.1 dovrà trovarsi in basso a sinistra e il campione 8 in basso a destra sul lato corto:

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Nella compilazione del form vi chiediamo di seguire i seguenti accorgimenti:
- utilizzare la versione più aggiornata del nostro form che potete scaricare in fondo alla pagina;
- indicare sempre con una X il tipo di servizio richiesto (Sequenziamento Standard o Sequenziamento e basta);
- utilizzare un unico form a prescindere dal tipo di templato (pcr o plasmidico) riportando eventuali commenti nelle sezioni apposite;
- riportare i campioni sempre con cognome e numero (in ordine progressivo a partire da 01, così come le provette), a seguire possono essere riportate tutte le altre informazioni relative al campione. Esempio:

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Spedizione campioni
I campioni da sequenziare vanno recapitati a questo indirizzo:
Bio-Fab research srl
Via di Castel Romano, 100
Ricezione merci, palazzina 1 C
00128 ROMA

PUNTO DI RACCOLTA per i clienti di Roma e dintorni: è attivo un punto di raccolta campioni presso l’Edificio di Fisiologia Generale (Dipartimento di Biologia e Biotecnologie - SAPIENZA Università di Roma) con ritiro gratuito giornaliero.

ISTRUZIONI PER LA CONSEGNA CAMPIONI: http://www.biofabresearch.it/site/index.php/novita-e-promozioni/117-nuovo-punto-di-raccolta-campioni-per-il-sequenziamento-biofab

ISTRUZIONI PER IL RITIRO OLIGO: http://www.biofabresearch.it/site/index.php/novita-e-promozioni/118-istruzioni-per-il-ritiro-oligo-biofab

SERVIZIO CORRIERE BIOFAB:
È possibile usufruire del nostro servizio di ritiro campioni tramite corriere al costo di 8,50 euro fino a 20 campioni, gratuito per oltre 20 campioni (anche cumulativi tra più laboratori). Per prenotare un ritiro inviare una mail a Questo indirizzo email è protetto dagli spambots. È necessario abilitare JavaScript per vederlo. e indicare:

• Giorno del ritiro
• Fascia oraria per il ritiro
• Indirizzo ed eventuali indicazioni aggiuntive utili per il corriere (piano, stanza, etc…)

I campioni andranno inseriti in una falcon o semplicemente protetti da un po' di pluriball per evitare che si danneggino le provette. Il tutto dovrà essere inserito all’interno di una busta assieme al form relativo, non occorre aggiungere ghiaccio. La busta non dovrà superare il peso limite di 1kg. Contestualmente alla conferma di prenotazione del ritiro, vi invieremo per mail la lettera di vettura che dovrà esser stampata e consegnata al corriere al momento del ritiro.

Risultati

Non appena le sequenze saranno pronte ti manderemo una e-mail (solitamente entro 24 ore dal ricevimento dei campioni). I file verranno caricati nella tua Area Riservata.

Per aprire un nuovo account basta seguire queste semplici istruzioni:
1. clicca sul pulsante AREA RISERVATA che trovi in alto in tutte le pagine del nostro sito,
2. entrerai in una nuova pagina:clicca sul pulsante “Non possiedi un account? Registrati”,
3. compila il form per l’iscrizione in ogni sua parte,
4. registrazione completata! Ora puoi entrare nella tua Area Riservata. Troverai le cartelle con le sequenze in Risultati laboratorio/Banca Oligo.

Per poter aprire i file di sequenza consigliamo i seguenti SOFTWARE:

AMBIENTE MACINTOSH:
FinchTv, scaricabile in formato .dmg o .zip al seguente indirizzo:
http://www.geospiza.com/ftvdlinfo.html

AMBIENTE WINDOWS:
Requisiti minimi hardware PC: Windows 3.x, Windows 95, 98, XP
Chromas, disponibile in versione freeware:
www.technelysium.com.au/chromas.html
Abiview!: scarica Abiview in formato zip

ALTRE PIATTAFORME (PC, Mac, Linux)
Consigliamo: TRACE VIEWEW a questo indirizzo: www.codoncode.com/TraceViewer

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