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sequenziamento  e genotyping
 

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Come preparare i campioni
 
Per avere buone sequenze bisogna avere un buon DNA. Ecco alcuni suggerimenti per preparare i tuoi campioni da sequenziare…e non dimenticare di eluire SEMPRE in ACQUA DISTILLATA!
Preparazione del DNA plasmidico:
• Usare ceppi batterici che non ricombinano (DH5a, HB101, XL1 Blue ecc.)
• Evitare contaminazioni (Genomico, RNA, proteine, Sali ecc)
• Estrarre il DNA con i kit commerciali con tecnologia a scambio ionico o per assorbimento membrana di silice
• Eliminare contaminanti che inibiscono la polimerasi (EDTA, Etanolo ecc)
• Eluire in acqua distillata
• Quantificare il DNA allo spettrofotometro (260/280 maggiore o uguale a 1.8)
Preparazione dei campioni da PCR:
• Amplificare nel modo più specifico possibile cercando di consumare tutti gli oligo durante la reazione e controllare il prodotto ottenuto su gel di agorosio
• Evitare contaminazioni (Genomico, RNA, proteine, Sali ecc)
• Estrarre il DNA con i kit commerciali con tecnologia ad assorbimento su membrana di silice o eventualmente fare una gel filtrazione (G50 sephadex)
• Evitare se possibile di estrarre il DNA dal gel di agarosio
• Eliminare contaminanti che inibiscono la polimerasi (EDTA, Etanolo, ecc)
• Eluire in acqua distillata
• Quantificare il DNA allo spettrofotometro (260/280 maggiore o uguale a 1.8)
Preparazione dei campioni per la sola elettroforesi:

Se volete fare da soli la reazione di sequenza dovete:
• Utilizzare il kit Big Dye Terminator V1.1 dell'AppliedBiosystems (P/N 4337450) o V3.1 (P/N 4337455)
• Purificare i campioni dal non incorporato (noi consigliamo la gel filtrazione con G50 sephadex)
• Utilizzare provette da 0,2 ml o micropiastre a 96 pozzetti per la spedizione dei campioni LIOFILIZZATI

 
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