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Come preparare i campioni |
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Per avere buone sequenze bisogna avere un buon DNA. Le varibili sono tante e non sempre si riesce a capire quale influisce sul risultato. L’esperienza comunque ci permette di garantire quasi sempre una buona lettura. Una nostra caratteristica, quando le sequenze vengono male, e’ quella di fare un altro tentativo cercando di modificare la variabile o qualche parametro che pensiamo di aver individuato come responsabile dell’insuccesso.
Ovviamente l’interazione con voi e’ determinante e per stimolarla mandiamo sempre i risultati con i nostri commenti, eventuali domande, suggerimenti ecc. In questo modo, quasi sempre, anche i DNA piu’ difficili prima o poi si fanno sequenziare!! Sappiate inoltre che per noi la sequenza e’ anche un mezzo di diagnosi, quindi a volte interpretare il risultato, anche se brutto, e’ comunque utile!!
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| Preparazione del DNA plasmidico: |
- Ecco un elenco di regole per prepare un buon DNA plasmidico da sequenziare:
- Usare ceppi batterici che non ricombinano (DH5a, HB101, XL1 Blue ecc.)
- Evitare contaminazioni (Genomico, RNA, proteine, Sali ecc)
- Estrarre il DNA con i kit commerciali con tecnologia a scambio ionico o per assorbimento membrana di silice
- Eliminare contaminanti che inibiscono la polimerasi (EDTA, Etanolo ecc)
- Eluire in acqua distillata
- Quantificare il DNA allo spettrofotometro (260/280 maggiore o uguale a 1.8)
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| Preparazione dell’amplificato: |
Per i frammenti di PCR la variabile della specificita’ dell’amplificato e’ fondamentale per ottenere buone letture. Una PCR aspecifica porta inevitabilemente ad una lettura mista. Invece, a volte, una buona PCR puo’ essere sequenziata anche senza bisogno di purificarla.
- Amplificare nel modo piu’ specifico possibile cercando di consumare gli tutti oligo durante la reazione e controllare il prodotto ottenuto su gel di agorsio
- Non usare Taq con Dye incorporato per il controllo su gel di agarosio
- Evitare contaminazioni (Genomico, RNA, proteine, Sali ecc)
- Estrarre il DNA con i kit commerciali con tecnologia ad assorbimento su membrana di silice o eventualmente fare una gel filtrazione (G50 sephadex)
- Evitare di estrarre il DNA dal gel di agarosio
- Eliminare contaminanti che inibiscono la polimerasi (EDTA, Etanolo, ecc)
- Eluire in acqua distillata
- Quantificare il DNA allo spettrofotometro (260/280 maggiore o uguale a 1.8)
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| Preparazione dei campioni per la sola elettroforesi: |
Se volete fare da soli la reazione di sequenza dovete:
- Utilizzare il kit Big Dye Terminator V1.1 dell'Applied Biosystems (P/N 4337450)
- Purificare i campioni dal non incorporato (noi consigliamo la gel filtrazione con G50 sephadex)
- Utilizzare provette da 0,2 ml o micropiastre a 96 pozzetti per la spedizione dei campioni LIOFILIZZATI
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