miRNA Sequencing

I miRNA sono corti frammenti (circa 22 nucleotidi) di RNA non codificante a singolo filamento principalmente attivi nella regolazione dell'espressione genica a livello trascrizionale e post-trascrizionale. Il riconoscimento del bersaglio avviene tramite complementarietà di basi e comporta una repressione della traduzione o la degradazione della molecola di mRNA. Finora, nell’uomo sono stati identificati quasi un migliaio di miRNA e si stima che almeno il 60% di tutti i geni umani siano regolati post-trascrizionalmente da queste piccole molecole.

Poiché una singolo miRNA può silenziare più di 200 diverse sequenze di RNA messaggero queste molecole giocano un ruolo fondamentale in diversi processi cellulari quali la proliferazione, lo sviluppo, la differenziazione, l’apoptosi e la risposta agli stress; inoltre, numerosi studi hanno evidenziato che il silenziamento mediato dai miRNA e’ coinvolto nello sviluppo e progressione di numerose patologie umane.

La loro caratterizzazione rappresenta quindi un nuovo potente strumento nella diagnosi e nel trattamento di diverse patologie umane. In particolare la presenza dei miRNA nei fluidi biologici li rende dei potenziali marcatori utilizzabili in applicazioni cliniche di diagnostica precoce, non invasiva, e nel monitoraggio di nuove strategie terapeutiche.

Il servizio di miRNA-seq della Bio-Fab fornisce un’analisi completa di tutti i miRNA presenti nel campione d’interesse. Il nostro servizio include sia l’identificazione di nuovi microRNA che l’analisi di espressione di tutti i miRNA noti, cosi’ come la conta degli isomiR.

Quanti milioni di reads sono richiesti per una miRNA sequencing?

Dipende dall’applicazione ma in generale, per studi di espressione si va da un minimo di 100K reads ad un max di 2M di reads. Per l’identificazione di nuovi miRNA o miRNA poco espressi sono necessarie almeno 5M di reads.

Preparazione della library

Tutti i kit commerciali attualmente disponibili per la preparazione di library di microRNA sfruttano la presenza sulla molecola del fosfato in 5’e dell’OH in 3’, che permette sia la selezione che l’arricchimento di questa specie di piccoli RNA.

Il primo passaggio nella costruzione della library prevede l’aggiunta tramite ligasi di un adattatore al 3’ della molecola di RNA. La reazione avviene in assenza di ATP ed è mediata dal gruppo OH presente al 3’ del mirRNA; in questo modo altre specie di RNA presenti nel campione non possono partecipare alla reazione ed il 3’ dell’adattatore, essendo bloccato, non subisce fenomeni di self-ligation.

Il secondo passaggio è ancora una reazione di ligasi che prevede l’aggiunta di un adattatore al 5’ Fosfato del miRNA.

Dopo l’aggiunta degli adattatori ad entrambe le estremità si procede con la trascrizione inversa utilizzando un primer complementare alla sequenza dell’adattatore in 3’. Segue un’amplificazione per pcr con degli oligo specifici che permettono l’aggiunta delle sequenze di legame alla flow cell ed i barcode per l’identificazione dei campioni in fase di analisi.

L'amplificato finale della library di miRNA consiste in molecole costituite da 120 basi di sequenze adattatrici piu' un inserto di lunghezza compresa fra le 22 e le 30 basi. Prodotti di peso molecolare maggiore vengono prodotti nel corso della reazione (tRNA, soRNA, piRNA ed altri frammenti di RNA), ma possono essere rimossi mediante una purificazione con beads magnetiche o PAGE purification. durante il sequenziamento la lettura avviene dal 5' al 3' della molecola di RNA.

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